Измерение оптической плотности растворов исследуемых веществ фотоколориметрия

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИЧЕСКОЙ ПЛОТНОСТИ РАСТВОРОВ С ПОМОЩЬЮ ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕТРА

Цель работы. Изучить взаимодействие света с веществом, которое связано с законами поглощения и рассеивания света; фотобиологические процессы и спектры фотобиологического действия. Научить студентов с помощью фотоколориметра определять оптическую плотность растворов.

Актуальность. Способность молекул поглощать свет лежит в основе спектрофотометрии, используемой в биологии и медицине для качественного анализа исследуемых систем; количественного определения веществ; изучения физико-химического состояния биомолекул; определения площади эффективного сечения биомолекул, знание которой часто требуется для расчетов квантовых выходов фотобиологических процессов.

Зная квантовый выход, можно получить информацию о структуре и функции биологических систем различной сложности: от мембран до целых органов и организмов и лекарственных препаратов. Высоким квантовым выходом обладают белки, флавины, витамины А и В₂, другие лекарственные вещества.

Спектры фотобиологического действия позволяют не только выяснить, какая область спектра наиболее эффективно вызывает данный фотобиологический процесс, но и какое вещество является акцептором квантов света в данном биологическом процессе.

Приборы и принадлежности: фотоэлектроколориметр (ФЭК), две кюветы, растворы рибофлавина с концентрациями: 0,75; 1,5; 3; 6.

Теоретическая часть

Закон Бугера.Одним из законов поглощения света является закон, полученный Бугером.

Пусть свет проходит через слой вещества толщиной d, интенсивность света на входе вещества I₀, на выходе — I_d (рис.1). Возьмем произвольно слой толщиной dx. Ослабление интенсивности света в этом слое обозначим через dI, величина которого зависит от толщины слоя d и интенсивности света I, падающего на этот слой:

,

где k – натуральный показатель поглощения, величина которого зависит от поглощающей среды, и длины световой волны и не зависит (в определенных пределах) от интенсивности света.

Знак «-» показывает на уменьшение интенсивности при прохождении света через вещество.

Для получения закона Бугера решаем составленное дифференциальное уравнение.

Делим обе части на I:

.

Интегрируем обе части и подставляем пределы интегрирования:

;

;

.

Подводим левую часть под общий логарифм:

.

.

.

Графически закон Бугера представляет собой экспоненту (рис.2)

С учетом зависимости величины k от длины световой волны l формула закона Бугера примет вид:

,

где k_λ – монохроматический показатель поглощения света.

Закон Бугера-Ламберта- Бера.Для вывода закона Бугера-Ламберта-Бера введем понятие эффективного сечения поглощения молекулы s.

Эффективным сечением поглощения молекулы называется некоторая площадь вокруг молекулы. При попадании в нее фотона происходит его захват молекулой, т.е. произойдет поглощение.

Пусть свет интенсивностью I₀ падает перпендикулярно к боковой поверхности прямоугольного параллелепипеда с площадью S (рис. 3). На выходе слоя толщиной d интенсивность I_d. В прямоугольном параллелепипеде выделим слой толщиной dx, объем данного слоя будет равен S· dx. Концентрацию молекул в объеме параллелепипеда обозначим через n, тогда количество молекул в слое dx будет равно n·S·dx. Общая площадь эффективного сечения молекул этого слоя будет равна s·n·S·dx, т.е. если фотон попадает в эту площадь, то он будет захвачен молекулой, произойдет процесс поглощения.

Следовательно, вероятность взаимодействия одного фотона с молекулами выделенного слоя будет равна:

.

То есть, изменение интенсивности dI по отношению к интенсивности света I, падающего на слой толщиной dx, будет пропорционально вероятности, что процесс поглощения произошел

.

Проинтегрируем обе части равенства:

.

.

.

.

Предположим, что молекулы поглощающего вещества находятся в растворителе, который не поглощает свет .

,

где N_A – число Авагадро.

Следовательно, .

Тогда произведение

где — натуральный молярный показатель поглощения, равный , т.е. это есть суммарное эффективное сечение поглощения всех молекул одного моля растворенного вещества (физический смысл ).

С учетом закон Бугера-Ламберта-Бера принимает следующий вид:

.

На практике закон Бугера-Ламберта-Бера применяют в следующем виде:

,

где – молярный показатель поглощения:

.

Для устранения зависимости от длины световой волны l вводится монохроматический молярный показатель поглощения _, тогда:

.

Коэффициент пропускания и оптическая плотность растворов. Отношение интенсивности света на выходе вещества I_d к интенсивности на входе I₀ называется коэффициентом пропускания t::

.

Десятичный логарифм величины, обратной коэффициенту пропускания, называется оптической плотностью раствора Д:

.

На основании закона Бугера-Ламберта-Бера разработаны методы по определению концентрации веществ в окрашенных растворах (концентрационная колориметрия).

Зависимости называются спектрами поглощения вещества. Они являются источниками информации о состоянии вещества и о структуре энергетических уровней атомов и молекул.

Рассеяние света.Процесс рассеяния света заключается в отклонении по всем направлениям светового пучка, проходящего через оптически неоднородную среду.

Под оптически неоднородной средой подразумевается прозрачная для света среда с вкраплением областей, обладающих иным показателем преломления по сравнению со средой. Различают три типа неоднородностей: мелкие,ая работаны методы по определению концентрации веществ в окращенных растворах (концентрационю раствора еский определнных предел средние, крупные.

Рэлей установил, что в случае мелких неоднородностей (дым, туман, взвеси, эмульсии), а также при молекулярном рассеянии интенсивность рассеянного света обратно пропорциональна четвертой степени длины световой волны l (закон Рэлея):

.

Для среднедисперсной среды:

.

Для крупнодисперсной среды:

.

Уменьшение интенсивности света в результате рассеяния, как и при поглощении, описывают показательной функцией:

,

где m – натуральный показатель рассеяния.

Процессы поглощения и рассеяния света идут одновременно. С учетом обоих процессов уменьшение интенсивности света определяется следующей функцией:

.

Фотобиологические процессы.К фотобиологическим относятся процессы, начинающиеся с поглощения света одним из биообъектов и заканчивающиеся определенной физиологической реакцией организма. Различают негативные и позитивные фотобиологические процессы.

Негативные фотобиологические эффекты в организма человека и животных бывают двух типов:

1. Фототоксический эффект вызывает повреждение кожи или глаз, не сопровождающиеся аллергическими реакциями, проявляющимися в форме эритемы, эдемы, пигментации, помутнения хрусталика и т.д.

2. Фотоаллергический эффект включает в себя первичный иммунологический механизм.

К позитивным фотобиологическим эффектам относятся:

1. Зрение.
2. Фотопериодизм – это регуляция суточных и годовых циклов жизни человека путем циклических воздействий свет — темнота. Процесс идет под действием видимого света. Фотопериодическим рецептором у человека являются глаза.
3. Образования витамина Д из провитаминов под действием ультрафиолета.

Фотобиологические процессы можно разбить на ряд стадий:

1. Поглощение кванта света.

2. Внутримолекулярные процессы размена энергии.

3. Межмолекулярный перенос энергии возбужденного состояния.

4. Первичный фотохимический акт.

5. Темновые превращения первичных фотохимических продуктов, заканчивающиеся образованием стабильных продуктов.

6. Биохимические реакции с участием фотопродуктов.

7. Общефизиологический ответ на действие света.

Биофизика занимается изучением только первых четырех процессов и частично темновых процессов, непосредственно следующих за первичным фотохимическим актом.

Спектры фотобиологического действия.Спектром фотобиологического действия называется зависимость фотобиологического эффекта от длины волны действующего света.

Рассмотрим один из типов спектра фотобиологического действия. Пусть на кювету падает свет интенсивностью I₀, на выходе кюветы интенсивность света I. Толщину кюветы обозначим через l. В кювете находится разбавленный раствор фермента с концентрацией n.

В результате процесса поглощения концентрация n фермента в растворе будет уменьшаться, следовательно, запишем равенство:

где — поперечное сечение поглощения фермента;

— скорость изменения концентрации фермента;

— квантовый выход фотохимической реакции;

знак «-» показывает на уменьшение концентрации со временем.

Решаем дифференциальное уравнение I-го порядка с разделяющимися переменными:

;

где n₀— начальная концентрация фермента в растворе (в момент времени t=0),

n_t — концентрация в момент времени t.

.

.

Произведения I₀ на время t: — доза облучения, , s_х — эффективное сечение молекулы для фотохимического превращения.

Подставим эти параметры (Д и s) в полученное выше уравнение и получим:

.

Для определения s_х строят график зависимости величина s_х определяет наклон прямой (рис.5).

Рис. 4. Дозовая зависимость инактивации фермента.

При воздействии на бактерии ультрафиолетом было установлено, что кривая гибели бактерий имеет максимум в области 265 нм, а также, что форма этой кривой очень напоминает спектр поглощения нуклеиновых кислот. Поэтому был сделан вывод, что гибель бактерий под действием ультрафиолета связана с повреждением нуклеиновых кислот.

Оптическая схема ФЭК

1 – осветитель; 2 – конденсор (дает изображение нити накала осветителя в плоскости диафрагмы); 3 – диафрагма; 4 – объектив; 5 – светофильтр (монохроматор); 6 – кювета; 7 – пластина, делящая световой поток на два: 10% светового потока направляется на фотодиод (8), а 90% — на фотоэлемент (9).

Источник

Фотометрические методы анализа (стр. 2 )

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4

Характерными полосами поглощения обладают соединения, содержащие хромофорные группы (см. раздел 1.3.2). Спектральные исследования в этой области часто дают полезную качественную информацию о наличии или отсутствии некоторых функциональных групп, таких как карбонил, ароматическое кольцо, нитрогруппа или сопряженная двойная связь. Следует иметь в виду, что идентификация надежна, если хромофоры в молекуле изолированы. В присутствии ауксохромов и цепей сопряжения идентификация затрудняется.

1.5.2. Количественный анализ методами фотометрии

В фотометрическом анализе количество вещества определяется по интенсивности окраски или светопоглощению окрашенных соединений. Раствор или предмет кажутся окрашенными, если он по-разному пропускает или поглощает видимый свет различных длин волн. В видимой области цвет раствора обусловлен длиной волны излучения, не поглощенного этим раствором. Например, раствор, поглощающий излучение в синей части спектра (»475 нм), окрашен в желтый цвет, т. е. синий цвет является дополнительным к окраске раствора. В таблице 1.3 приводятся такие данные для всей области видимого излучения.

Абсорбционная спектроскопия, особенно в видимой и УФ-областях – один из наиболее распространенных методов количественного анализа. Фотометрические методы используют для определения веществ с собственным поглощением (органические вещества с хромофорными группами,

переходные металлы), а также для определения непоглощающих веществ.

При определении неорганических компонентов для получения окрашенных соединений чаще всего используют реакции образования (иногда – разрушения) комплексных соединений; значительно реже применяются реакции окисления-восстановления. Для фотометрического определения

Таблица 1.3. Цвета видимого излучения

Область максимального поглощения, нм

органических компонентов чаще всего используют реакции синтеза окрашенных соединений. Такие реакции называют фотометрическими.

Основные требования к реакциям сводятся к следующему: избирательное действие реагента, высокая скорость реакции, большое значение константы равновесия, постоянство состава и устойчивость окрашенных соединений во время проведения анализа. Важное значение в связи с этим имеют рН среды, время реакции, концентрации реагентов, температура.

1.5.3. Основные этапы анализа в фотометрии

Прежде чем приступить к выполнению фотометрического определения необходимо выбрать условия анализа. Можно рекомендовать следующую схему.

– перевод анализируемого образца в раствор и отделение, в случае необходимости, мешающих компонентов;

– выбор фотометрической формы вещества и проведение химических реакций для получения окрашенного соединения (если определяемое вещество не обладает интенсивным собственным поглощением)

– установление области концентраций, в которой выполняется основной закон светопоглощения:

– измерение оптической плотности исследуемого раствора;

– расчет содержания вещества в анализируемой пробе и его метрологическая оценка.

1.5.4. Метрологические характеристики метода

Чувствительность характеризуется углом наклона градуировочного графика. Тангенс угла наклона равен молярному коэффициенту поглощения. Если принять минимальное значение оптической плотности, измеренное с необходимой точностью, Аmin = 0,01, можно рассчитать минимально определяемую концентрацию:

При величинах e » 105 чувствительность определения может составлять 10–7–10–6 М.

Воспроизводимость. Для получения воспроизводимых результатов необходимо учитывать погрешности при измерении оптической плотности. Измерительное устройство фотометрического прибора обычно имеет постоянную по всей шкале погрешность измерения в величине пропускания Т, погрешность измерения величины А не будет одинакова, так как А = – lgТ. Относительная погрешность определения концентрации DС/C имеет минимальное значение при Т = 0,37 или оптической плотности А = 0,435. Для измерения концентрации с погрешностью, не превышающей удвоенной минимальной, нужно проводить измерение А в интервале 0,1–1,0. Для снижения случайной погрешности измерения в области больших и малых значений А существуют специальные приемы, один из них – дифференциальный метод анализа.

Правильность. Систематические погрешности в фотометрии могут возникнуть в связи с отклонениями от закона Бера, в связи с немонохроматичностью светового потока и химическими взаимодействиями в измеряемой системе, а также при наличии примесей, которые поглощают свет в данной области спектра. Для снижения систематической ошибки существуют специальные приемы, как, например, приготовление раствора сравнения, содержащего все компоненты, кроме определяемого.

Точность фотометрических методов зависит от индивидуальных особенностей фотометрической реакции, характеристик применяемого прибора и других факторов. Обычная относительная погрешность фотометрических методов составляет 1–2%.

1.5.5. Анализ однокомпонентных систем фотометрическим методом

Метод сравнения оптических плотностей стандартного и исследуемого соединений. Для анализа вещества этим способом готовят раствор исследуемого вещества и два-три стандартных раствора, затем измеряют оптические плотности этих растворов в одинаковых условиях (длина волны, толщина поглощающего слоя). Погрешность определения будет меньше, если оптические плотности исследуемого и стандартного растворов будут иметь близкие значения. Для этого вначале фотометрируют исследуемый раствор, а затем подбирают нужную концентрацию стандартного раствора. Согласно закону Бера, оптические плотности исследуемого и стандартного растворов равны:

Разделив уравнение (1.9) на (1.10) и учитывая, что оптические плотности измеряют в одних и тех же условиях (l = const, l = const) и в растворе одни и те же светопоглощающие частицы (el = const), получим:

Метод сравнения используется для единичных анализов и требует обязательного соблюдения закона Бера.

Метод молярного коэффициента поглощения. При работе по этому методу определяют оптическую плотность нескольких стандартных растворов Аст, для каждого стандартного раствора рассчитывают молярный коэффициент поглощения:

и полученное значение e усредняют. Поскольку молярный коэффициент светопоглощения не зависит от толщины поглощающего слоя, измерения можно проводить в кюветах разной длины. Затем измеряют оптическую плотность исследуемого раствора Ах и рассчитывают концентрацию Сх:

Метод требует обязательного соблюдения закона Бера хотя бы в области исследуемых концентраций; используется довольно редко.

Метод градуировочного графика. В соответствии с законом Бугера – Ламберта – Бера график зависимости оптической плотности от концентрации должен быть линейным и проходить через начало координат.

Готовят серию стандартных растворов различной концентрации и измеряют оптическую плотность в одинаковых условиях. Для повышения точности определения число точек на графике должно быть не меньше трех-четырех. Затем определяют оптическую плотность исследуемого раствора Ах и по графику находят соответствующее ей значение концентрации Сх (рис.1.7).

Интервал концентраций стандартных растворов подбирают таким образом, чтобы концентрация исследуемого раствора соответствовала примерно середине этого интервала.

Метод является наиболее распространенным в фотометрии. Основные ограничения метода связаны с трудоемким процессом приготовления эталонных растворов и необходимостью учитывать влияние посторонних компонентов в исследуемом растворе. Чаще всего метод применяется для проведения серийных анализов.

Рис.1.7. Градуировочный график зависимости оптической

плотности от концентрации

Метод добавок. Этот метод применяют для анализа сложных растворов, так как он позволяет автоматически учитывать влияние посторонних компонентов анализируемого образца. Сначала измеряют оптическую плотность исследуемого раствора с неизвестной концентрацией

затем в анализируемый раствор добавляют известное количество стандартного раствора определяемого компонента (Сст) и измеряют оптическую плотность А х+ст:

Для повышения точности добавку стандартного раствора определяемого компонента делают дважды и полученный результат усредняют.

Концентрацию анализируемого вещества в методе добавок можно найти графичеcким путем (рис.1.8).

Рис.1.8. Градуировочный график для определения

концентрации вещества по методу добавок

Уравнение (1.16) показывает, что если строить график Ах+ст как функции Сст, то получится прямая, экстраполяция которой до пересечения с осью абсцисс дает отрезок, равный –Сх. Действительно, при Ах+ст = 0 из уравнения (1.16) следует, что –Сст = Сх.

Метод дифференциальной фотометрии. В этом методе оптические плотности исследуемого и стандартных растворов измеряют не по отношению к растворителю или раствору сравнения с нулевым поглощением, а, в отличие от прямых спектрофотометрических методов, по отношению к раствору с известной концентрацией определяемого вещества Со.

В зависимости от способов измерения относительной оптической плотности различают несколько вариантов метода.

1.Метод высокого поглощения – концентрация раствора сравнения меньше концентрации исследуемого раствора (Со Сх). В этом случае применяют обратный порядок измерения: анализируемый и стандартные растворы условно принимают за растворы сравнения и по отношению к ним измеряют оптическую плотность изначального раствора сравнения. При обратном порядке измерения относительная оптическая плотность А¢ равна разности оптических плотностей исследуемого раствора (стандартного) и раствора сравнения:

Концентрацию Сх рассчитывают по формуле:

Источник