Как измерить молекулу белка

Молекулярная масса и размеры белков. Методы определения молекулярной массы белков. Необходимость применения комплекса методов для точной оценки молекулярной массы белков

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры белка. Такие полипептидные цепи называются субъединицами. Их молекулярная масса варьирует в широких пределах: от 6000 до 100000 и более. Для выражения молекулярной массы белков используют также специальную единицу – дальтон.

Дальтон (Да) – единица массы, практически равная массе атома водорода (т.е. 1,0000 по шкале атомных масс). Терминами «дальтон» и «молекулярная масса» пользуются как взаимозаменяемыми: например, белок в 20000 дальтон имеет молекулярную массу 20000. Наименование дано в честь Джона Дальтона, разработавшего атомарную теорию строения материи. Килодальтон (кДа) – единица массы, равная 1000 дальтон. Масса большинства белков лежит в пределах от 10 до 100 кДа.

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике чаще всего используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез.

При определении молекулярной массы белков методами седиментационного анализа используют аналитические ультрацентрифуги (первая ультрацентрифуга была сконструирована в 1923 г. Т. Сведбергом), в которых удается создать центробежные ускорения (g), в 200000 и более раз превышающие ускорение земного притяжения. Обычно молекулярную массу вычисляют по скорости седиментации молекул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница «растворитель-белок» (регистрируется автоматически). Оптические свойства растворителя и белка используются при определении скорости седиментации; которую выражают через константу седиментации s, зависящую как от массы, так и от формы белковой частицы:

где v – скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с; ω – угловая скорость ротора, рад/с; r – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка, см. Константа седиментации имеет размерность времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации, равная 1·10 –13 с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S). Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах 1–50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S.

Для вычисления молекулярной массы, помимо константы седиментации, необходимы дополнительные сведения о плотности растворителя и белка и другие согласно уравнению Сведберга:

где R – газовая постоянная, эрг/(моль∙гр.); Т – абсолютная температура (по шкале Кельвина); S – константа седиментации; ρ – плотность растворителя; v – парциальный удельный объем молекулы белка; D ‒ коэффициент диффузии.

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны простые методы (гель-хроматография и электрофорез).

Гель-хроматографию проводят при заполнении колонки пористым гелем сефадекса. Через колонку пропускают ряд белков с известной молекулярной массой и строят график зависимости логарифма молекулярной массы от значений их элюционных объемов. Между логарифмом молекулярной массы белка, имеющего сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая зависимость. Легко определить молекулярную массу исследуемого белка, зная его объем элюции.

Второй разновидностью этого метода является тонкослойная гель-хроматография. Длина пробега белка через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от его молекулярной массы (рис.7.1).

Рис.7.1. Зависимость между длиной пробега белковых частиц при гель-хроматографии в тонком слое сефадекса G-150 и их молекулярными массами

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис.7.2).

Рис.7.2. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле. присутствии додецилсульфата натрия

Электрофорез проводят в присутствии детергента – додецилсульфата натрия (SDS), т.к. только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между логарифмом молекулярной массы и подвижностью белков.

Источник

Молекулярная масса белков

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры белка. Такие полипептидные цепи получили название субъединиц. Их мол. масса варьирует в широких пределах – от 6000 до 100000 и более.

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определение молекулярной массы белков методами седиментационного анализа проводят в ультрацентрифугах , в которых удается создать центробежные ускорения (g), превышающие в 200000 и более раз ускорение земного притяжения. Обычно вычисляют молекулярную массу по скорости седиментации молекул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница растворитель-белок (регистрируется автоматически). Оптические свойства растворителя и белка используются при определении скорости седиментации; последнюю выражают через константу седиментации s, которая зависит как от массы, так и от формы белковой частицы:

где v – скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с; ω – угловая скорость ротора, рад/с; r – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка, см. Константа седиментации имеет размерность времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации, равная 1•10 –13 с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S). Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах 1–50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S.

Для вычисления молекулярной массы (М), помимо константы седиментации, необходимы дополнительные сведения о плотности растворителя и белка и другие согласно уравнению Сведберга:

где R – газовая постоянная, эрг/(моль•град); Т – абсолютная температура (по шкале Кельвина); s – константа седиментации; ρ – плотность растворителя; v – парциальный удельный объем молекулы белка; D — коэффициент диффузии.

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель-хроматография и электрофорез). При использовании гель-хроматографии в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молекулярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов молекулярной массы против их элюционных объемов, которые находят, как показано на рис. 1.9.

Известно, что между логарифмом молекулярной массы белка, имеющего сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая зависимость. Поэтому легко определить молекулярную массу исследуемого белка, зная его объем элюции. Второй разновидностью этого метода является тонкослойная гель-хроматография. Длина пробега белка (в миллиметрах) через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от молекулярной массы белка (рис. 1.10).

Рис. 1.9. Измерение объема элюции (V_Э).

Рис. 1.10. Зависимость между длиной пробега белковых частиц при гель-хроматографии в тонком слое сефадекса Г-150 (сверхтонкого) и их молекулярными массами (в полулогарифмической системе координат).

1 — рибонуклеаза; 2 — химотрипсиноген; 3 -яичный альбумин; 4 — сывороточный альбумин; 5 — γ-глобулин; Х — белок с неизвестной молекулярной массой.

Гель-хроматография, кроме простоты и быстроты, имеет дополнительное преимущество: не требуется выделять белок в чистом виде, так как примеси других белков не мешают определению, поскольку каждый из них проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемой молекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимологии, когда оказывается возможным определение молекулярной массы даже очень небольшого количества фермента в присутствии других белков, не обладающих аналогичной каталитической активностью.

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения молекулярной массы белков также строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11). Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение для определения молекулярной массы субъединиц белка.

Рис. 1.11. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогарифмической системе координат).

1 — сывороточный альбумин; 2 — яичный альбумин; 3 — пепсин; 4 — химотрипсиноген; 5 — мио-глобин; 6 — цитохром с; Х — белок с неизвестной молекулярной массой.

Недавно предложен новый масс-спектрометрический метод (так называемый лазерный десорбционно-ионизационный метод), позволяющий определять молекулярную массу небольших пептидов (вазопрессин, инсулин) и крупных биополимерных молекул и, кроме того, структуру биомолекул.

Источник

Методы для определения молекулярных масс белков

Форма молекул взаимосвязана с функциональной ролью в клетке.

Форма и размер белковых молекул

Физико-химические свойства белков

Белок диссоциирует на субъединицы под действием реагентов, разрывающих слабые связи (мочевина, детергенты, солевые растворы).

РЕЗЮМЕ

Белки состоят из аминокислотных остатков, связанных между собой пептидными связями, образующих полипептидные цепочки, которые благодаря водородным, ионным, дисульфидным связям и гидрофобным взаимодействиям определенным образом располагаются в пространстве, т.е. имеют определенную конформацию. При нормальных физиологических условиях белок имеет нативную конформацию.

3 типа белков:

— Фибриллярные, образующие длинные волокна без значительного числа изгибов и петель. Содержатся в костях, сухожилиях, шелк (кератин волос, рогов, фиброин шёлка). Они не растворимы в воде и разбавленных солевых растворах.

— Глобулярные, имеющие компактную форму запутанного клубка, которая благоприятна для взаимодействия с другими молекулами (ферменты, гормоны);

Форму белковой молекулы выражают отношением длины большой оси к малой: в/а. Глобулярные белки могут различаться по форме: сигара, эллипсоид вращения, иглы и т. д. Растворимые в воде.

— Промежуточный тип: растворимые в водных, солевых растворах, но состоящие из длинных фибриллярных структур (Миозин – белок мышц, фибриноген крови).

2.2 Молекулярные массы белков колеблются от

6000 до 1 000 000 Да и выше. 1 дальтон = 1,661 * 10 -24 грамм.

2.2.1 Осмотическое давление. Если вещество, растворенное в воде, отделено от чистой воды мембраной, проницаемой для воды и непроницаемой для вещества, то вода будет поступать внутрь объема, где находится раствор. Уровень воды в мембранном пространстве поднимется. Это избыточное давление равно осмотическому давлению (π ).

π = R* C *T ,

где π -осмотическое давление в атмосферах;

R – универсальная газовая постоянная;

С – молярная концентрация растворенного вещества;

Т – абсолютная температура

,

где c – концентрация в граммах на литр; М – молекулярный вес.

π = М = (R c T) / π

2.2.2 Метод седиментацоннго анализа. разработан в 1925г. Сведбергом, основан на применении ультрацентрифугирования. В ультрацентрифуге в сотни тысяч раз увеличивается сила тяжести и молекулы белка оседают в растворе. По скорости их оседания (седиментации) вычисляют молекулярную массу белка.

2.2.3. Диффузионный метод – определение скорости диффузии, которая обратно пропорциональна величине молекулярного вещества.

2.2.4. По светорассеиванию

Источник

Молекулярная масса белков и методы её определения

Молекулярные массы белков колеблются от 6 тыс. до нескольких миллионов дальтон:

Белок

Молекулярная масса

Рибонуклеаза поджелудочной железы

Глутаматдегидрогеназа печени быка

Вирус табачной мозаики-рибонуклеопротеин

Молекулярные, массы (М.м.) белков определяют специальными химическими и физическими методами. Один из химических методов основан на определении аминокислотного состава белка. Знания аминокислотного состава и первичной структуры белка позволяют с высокой точностью вычислить его М.м. (Средняя М.м. остатка аминокислоты в полипептидной цепи составляет 110).

Т.Сведберг в 1925 г. предложил гравитационный метод определения М.м., основанный на скорости седиментации (оседания) молекул белка в растворе при ультрацентрифугировании. Скорость седиментации выражают в единицах Сведберга, например: 5S, 5,8S, I8S, 40S и т.д.

В настоящее время разработаны и используются более простые и эффективные методы определения М.м. белков: хроматографический (гельфильтрационный) и электрофоретический. Определение методом гельфильтрации начинают с калибровки колонки. Для этого через колонку с сефадексом пропускают 5-6 белков с известными М.м. и строят график, откладывая значения логарифмов М.м. против их элюционных объемов (объем растворителя необходимый для извлечения конкретного белка). Пользуясь графиком, М.м. исследуемого белка определяют по величине его элюционного объема т.к. между логарифмом М.м. глобулярного белка и элюционным объемом существует прямая зависимость.

Разновидностью метода является тонкослойная гельфильтрация или тонкослойная хроматография (гель тонким слоем наносят на твердую основу). Длина пробега белка (в мм.) через тонкий слои сефадекса находится в логарифмической зависимости от М.м. белка.

Метод гельфильрации имеет преимущество в том, что не требуется предварительной очистки белка, т.к. каждый из сопутствующих белков проходит через колонку со своей скоростью, определяемой М.м..

При использовании метода диск-электрофореза в полиакриламидном геле также строят график зависимости между логарифмом М.м. калибровочных белков и величинами пробега белковых молекул, а затем, определив подвижность исследуемого белка в полиакриламидном геле, по графику находят его массу.

Современные методы позволяют определять М.м. белков с погрешностью до 5 %. Наиболее точный результат может быть получен при определении несколькими методами.

Поможем написать любую работу на аналогичную тему

Молекулярная масса белков и методы её определения

Молекулярная масса белков и методы её определения

Молекулярная масса белков и методы её определения

Источник

Молекулярная масса и размеры белков. Методы определения

Молекулярной массы белков. Необходимость применения комплекса

Методов для точной оценки молекулярной массы белков

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры белка. Такие полипептидные цепи называются субъединицами. Их молекулярная масса варьирует в широких пределах: от 6000 до 100000 и более. Для выражения молекулярной массы белков используют также специальную единицу – дальтон.

Дальтон (Да) – единица массы, практически равная массе атома водорода (т.е. 1,0000 по шкале атомных масс). Терминами «дальтон» и «молекулярная масса» пользуются как взаимозаменяемыми: например, белок в 20000 дальтон имеет молекулярную массу 20000. Наименование дано в честь Джона Дальтона, разработавшего атомарную теорию строения материи. Килодальтон (кДа) – единица массы, равная 1000 дальтон. Масса большинства белков лежит в пределах от 10 до 100 кДа.

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике чаще всего используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез.

При определении молекулярной массы белков методами седиментационного анализа используют аналитические ультрацентрифуги (первая ультрацентрифуга была сконструирована в 1923 г. Т. Сведбергом), в которых удается создать центробежные ускорения (g), в 200000 и более раз превышающие ускорение земного притяжения. Обычно молекулярную массу вычисляют по скорости седиментации молекул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница «растворитель-белок» (регистрируется автоматически). Оптические свойства растворителя и белка используются при определении скорости седиментации; которую выражают через константу седиментации s, зависящую как от массы, так и от формы белковой частицы:

V

S = —— ,

R

где v – скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с; ω – угловая скорость ротора, рад/с; r – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка, см. Константа седиментации имеет размерность времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации, равная 1·10 –13 с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S). Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах 1–50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S.

Для вычисления молекулярной массы, помимо константы седиментации, необходимы дополнительные сведения о плотности растворителя и белка и другие согласно уравнению Сведберга:

RTS

D (1- v ρ)

где R – газовая постоянная, эрг/(моль∙гр.); Т – абсолютная температура (по шкале Кельвина); S – константа седиментации; ρ – плотность растворителя; v – парциальный удельный объем молекулы белка; D ‒ коэффициент диффузии.

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны простые методы (гель-хроматография и электрофорез).

Гель-хроматографию проводят при заполнении колонки пористым гелем сефадекса. Через колонку пропускают ряд белков с известной молекулярной массой и строят график зависимости логарифма молекулярной массы от значений их элюционных объемов. Между логарифмом молекулярной массы белка, имеющего сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая зависимость. Легко определить молекулярную массу исследуемого белка, зная его объем элюции.

Второй разновидностью этого метода является тонкослойная гель-хроматография. Длина пробега белка через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от его молекулярной массы (рис.7.1).

Рис.7.1. Зависимость между длиной пробега белковых частиц при гель-хроматографии в тонком слое сефадекса G-150 и их молекулярными массами

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис.7.2).

Рис.7.2. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле. присутствии додецилсульфата натрия

Электрофорез проводят в присутствии детергента – додецилсульфата натрия (SDS), т.к. только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между логарифмом молекулярной массы и подвижностью белков.

Денатурация белков

Природные белки имеют определенную, строго заданную пространственную конфигурацию и характерные физико-химические и биологические свойства при физиологических значениях температуры и рН среды. Под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства, т.е. денатурируют. Денатурация ‒ нарушение уникальной структуры нативной молекулы белка, ее третичной структуры, приводящее к потере характерных свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность, биологическая активность и т.д.) (рис.7.3). Большинство белков денатурирует уже при нагревании их растворов выше 50–60°С.

Рис.7.3. Денатурация белка: а) нативный белок; б) стадия обратимой денатурации; в) стадия необратимой денатурации

При денатурации происходит потеря растворимости белка, особенно в изоэлектрической точке, повышение вязкости белковых растворов, увеличение количества свободных функциональных SH-групп и изменение характера рассеивания рентгеновских лучей. Характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической, антигенной или гормональной). При денатурации белка разрушаются в основном нековалентные связи (в частности, гидрофобные взаимодействия и водородные связи). Дисульфидные связи в присутствии восстанавливающего агента меркаптоэтанола разрываются, в то время как пептидные связи самого остова полипептидной цепи не затрагиваются. В этих условиях развертываются глобулы нативных белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры.

Денатурация белков с потерей биологической активности может происходить под действием высокой температуры, ультрафиолетового излучения, кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов. Денатурация бывает обратимой (ренатурация) и необратимой.

Источник