Единицы для измерения активности ферментов

Единицы активности ферментов.

При оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах Комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица (Е или U): за единицу активности любого фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоля субстрата или образование 1 микромоля продукта в минуту (мкмоль/мин).

Единица активности (Е) – это количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в мин при стандартных условиях (в оптимуме рН, при избытке субстрата, температуре 37 или 20º С).

Единица активности U (1U) фермента-это такое его количество, которое при определенных условиях катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в 1 мин, или, если атаке подвергается более, чем одна связь в молекуле субстрата, 1 мкэкв (группы) в 1 мин.

Комиссия по ферментам международного биохимического союза в 1972 г. предложила единицу активности фермента катал (сокращенно кат)

В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено новое выражение активности фермента в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). Отношение международной единицы (U) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 моль•с–1 = 60 моль•мин–1 = 60•106 мкмоль•мин–1 = 6•107 U, или: 1 U = 1 мкмоль•мин–1 = (1/60) мкмоль•с–1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1 U фермента соответствует 16,67 нкат.

Катал — это такое количество фермента, которое в определенных условиях катализирует превращение одного моля субстрата в секунду. Активность в один катал слишком высокая (.ферментативные превращения идут с меньшей скоростью), поэтому для выражения активности фермента используют микрокаталы (мккат =1×10-6 кат), нанокаталы (нкат =1×10-9 кат) и пикокаталы (пкат =1×10-12 кат), которые соответствуют превращению определенного количества микро-, нано- или пикомолей субстрата в сек.

Рекомендовано, кроме того, измерять активность фермента при температуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от концентрации фермента.

Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Количество молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято называть числом оборотов фермента, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в 1 с 44000 молекул перекиси водорода.

Для определения ферментативной активности используют следующие методы:

1. Химический метод – количественное определение субстрата или продуктов с помощью химических реагентов (О-гликозилгидролазы – по образованию восстанавливающих сахаров).

2. Спектрофотометрический метод – измерение скорости ферментативной реакции по изменению поглощения субстрата при характеристической длине волны (лиазы – по образованию двойной связи).

3. Манометрический метод – определение количества газа, выделяющегося в процессе реакции (оксидазы – по поглощению О2, декарбоксилазы – по выделению СО2).

4.Поляриметрический метод – фиксируется изменение оптического вращения (β-фруктофуранозидаза).

5. Хроматографический – количественное определение субстрата или продуктов с помощью различных видов хроматографии: бумажной (анализ сахаров), тонкослойной (гликозидов со сложными агликонами), ВЭЖХ (аминокислотный анализ и др.).

Дата добавления: 2019-11-16 ; просмотров: 321 ; Мы поможем в написании вашей работы!

Источник

Единицы измерения активности и количества фермента

1. Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.

В практике обычно используют:

• единицы количества вещества – моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),
• единицы времени – минута, час, секунда,
• единицы массы или объема – грамм (кг, мг), литр (мл).

Активно используются и другие производные – катал (моль/сек), международная единица активности — МЕ, (IU, I nternational U nit) соответствует мкмоль/мин.

Взаиморасчёт этих величин выглядит следующим образом:

1 катал = 1 моль/сек = 60 моль/мин = 60х10 6 мкмоль/мин = 6х10 7 ME

1ME = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/сек = 1/60 мккатал = 16, 67 нкат

Удельная активность фермента численно ровна количеству единиц активности фермента в биологическом образце (МЕ), делённому на массу (мг) белка в этой ткани. Обычно используется для оценки очистки фермента.

Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т.д.

• что 1 г пепсинарасщепляет 50 кг яичного белка за один час – таким образом, его активность составит 50 кг/час на 1 г фермента,
• если 1,6 мл слюны расщепляет 175 кг крахмала в час – активность α—амилазы слюны составит 109,4 кг крахмала в час на 1 мл слюны или 1,82 кг/мин×г или 30,3 г крахмала/ с×мл.

При определении активности ферментов необходимо создание стандартных условий, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях – оптимальная рН и фиксированная температура, например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом. Кроме того необходимо при этом наличие избытка субстрата, чтобы работали все имеющиеся в растворе молекулы фермента.

5. От чего зависит активность ферментов?

Источник

Что означает выражение «активность фермента»?

Прежде чем обсуждать свойства ферментов и зависимость ферментов от каких-либо факторов необходимо определиться с понятием активность ферментов.

В повседневной биохимической практике практически не оценивается количество фермента, а только его активность . Активность – более широкое понятие, чем количество. Она подразумевает в первую очередь результат реакции , а именно убыль субстрата или накопление продукта. Естественно, при этом нельзя игнорировать время, которое проработал фермент и число молекул фермента. Но так как число молекул фермента подсчитать обычно нереально, то используют количество биологического материала, содержащего фермент (объем или массу).

Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три переменные:

• масса полученного продукта или исчезнувшего субстрата,
• время, потраченное на реакцию,
• количество фермента, но на самом деле массу или объем биологического материала, содержащего фермент.

Для понимания соотношений указанных факторов наглядным и простым примером может служить строительство двух зданий. Здания приравняем к продукту реакции, рабочие – это ферменты, бригада пусть соответствует объему биологического материала. Итак, задачи из 3-го класса:

1. На постройке одного здания трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания – бригада из 5 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?

2. На постройке одного здания из 3 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого здания из 12 этажей – бригада тоже из 10 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?

3. На постройке одного здания из 5 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания – бригада тоже из 10 человек. Строительство первого здания заняло 20 дней, второе построено за 10 дней. Где выше активность рабочих?

Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.

В практике обычно используют:

• единицы количества вещества – моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),
• единицы времени – минута, час, секунда,
• единицы массы или объема – грамм (производные кг, мг), литр (мл).

В настоящее время в основном уже применяются единицы активности – катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.

Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т.д.

• что 1 г пепсина расщепляет 50 кг яичного белка за один час – таким образом, его активность составит 50 кг/час на 1 г фермента,
• если 1,6 мл слюны расщепляет 175 кг крахмала в час – активность амилазы слюны составит 109,4 кг крахмала в час на 1 мл слюны или 1,82 кг/мин×г или 30,3 г/с×мл.

Принципы количественного определения активности ферментов

1. Создание стандартных условий, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях – оптимальная рН и фиксированная температура , например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом.

2. Необходимо наличие избытка субстрата, чтобы в течение установленного времени работали все имеющиеся в растворе молекулы фермента.

Источник

9. Единицы измерения ферментативной активности

Активность – это изменение субстрата под влиянием фермента в единицу времени.

Международная единица активности (МЕ или U) – количество фермента, катализирующие превращение 1 мкмоля субстрата за 1 мин. В системе СИ используют «катал», который определяется как 1 моль/с. В сравнении с международной единицей:

1МЕ = 16,67 * 10 -9 катал

Контрольные вопросы.

Дайте определения следующим понятиям – ферменты, энергия активации, катализ, активный центр, аллостерический центр.

Что положено в основу классификации ферментов?

Каковы основные свойства ферментов?

Что называют изоферментами? Примеры.

Перечислите основные факторы, влияющие на активность ферментов.

Дайте определения следующим понятиям – энзимопатии, энзимотерапия, энзимодиагностика. Приведите примеры.

Лекция 16. Использование ферментов в медицине

4. Клинико-диагностическое значение определения некоторых ферментов.

1. Энзимопатии.

Энзимопатии – это заболевания, характеризующиеся нарушением содержания того или иного фермента в организме.

Наследственные энзимопатии – заболевания связанные с нарушением синтеза фермента, вызванного повреждением генетического аппарата клетки. Например, фенилкетонурия, в основе, которой лежит врожденный дефект фермента фенилаланин гидроксилазы: нарушено образование тирозина из фенинилаланина. Превращение фенилаланина идет по другому пути – с образованием фенилпировиноградной кислоты, фенилмолочной и фенилуксусной кислоты, которые в большом количестве выдеяются с мочой. Дефицит тирозина тормозит биосинтез его производных – норадреналина – медиатора в нервной системе, что приводит к дальнейшему поражению головного мозга и слабоумию.

Приобретенные энзимопатии – заболевания связанные с недостаточностью витаминов и минеральных веществ (алиментарные энзимопатии) или угнетением активности фермента токсинами (токсические энзимопатии). При недостатке витаминов могут возникать нарушения, так как если тот или другой витамин не поступает с пищей, кофермент не образуется и фермент остается неактивным.

2. Энзимотерапия.

Особое место занимает использование ферментов в качестве лечебных препаратов – энзимотерапия.

Фибринолизин применяют при лечении незаживающих ран, пролежней, для рассасывания тромбов. Лидаза используется после операции для предотвращения образования грубых рубцов. Пепсин применяется при лечении нарушений пищеварения. Вобэнзим — комплекс гидролитических ферментов (трипсин, химотрипсин, амилаза, урокиназа). Они способствуют устранению функциональных нарушений кровоснабжения, предупреждают появление атеросклероза.

3.Энзимодиагностика – использование ферментов в диагностике заболеваний. В нормальных условиях активность ферментов в сыворотке крови относительно невелика, по сравнению с их активностью в тканях. При поражениях ряда органов и тканей, что связано с нарушением проницаемости мембран клеток и выходом из них ферментов в кровяное русло, происходит увеличение их активности.

Количественно определяя нефункциональные ферменты плазмы (индикаторные ферменты), можно диагностировать заболевание. Например, при инфаркте миокарда повышается активность ферментов — АсАТ, КК, при заболеваниях костей – ЩФ.

Требования к ферментам, используемым в клинико-биохимических исследованиях:

Низкая активность в крови в норме.

Выход в кровь только при повреждении соответствующего органа.

Высокая стабильность в крови (не менее 1-2 часов).

Доступная методика определения активности фермента.

Недостатки ферментативного анализа:

Основным недостатком использования ферментов в диагностике повреждения тканей является отсутствие строгой специфичности по отношению к конкретной ткани или типу клеток.

Выход: определяют для каждого органа спектр ферментов (несколько ферментов, характерных для данной ткани: сердце-ЛДГ-1, КК-МВ, АсАТ), определяют изоферменты.

После повреждения ткани активность внутриклеточных ферментов в плазме возрастает по мере их освобождения из поврежденных клеток, а затем снижается в результате их клиренса.

Выход: важно строго учитывать время взятия пробы относительно первичного повреждения.

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Источник

Единицы измерения ферментативной активности

Методы определения изоферментов

· Электрофоретическиена различных носителях

· Термическое инактивирование(изоЕ ЩФ)

· Ингибирование различными веществами (КФ, ЛДГ1,2)

· Методы, основанные на различном сродстве к субстратам (ХЭ)

За единицу активности фермента принимают такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в единицу времени в расчёте на количество материала, взятого для исследования.

Международная единица активности (E) — это количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в 1 минуту в оптимальных условиях на 1 л биологической жидкости.

Единица активности в системе СИ (катал) — соответствует количеству фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата в 1 секунду на 1 л биологической жидкости.

Соотношение между единицами активности:

1 E = 16,67 нанокатал;

1 катал = 6×10 7 E.

Удельная активность фермента— это активность, выраженная в единицах активности на 1 мг (или 1 г) белка или 1 мг (1 г) препарата фермента. Используется в биохимической практике.

Распределение ферментов в организме:

1. Е клеточного обмена (органные, тканевые) — это основная масса ферментов, локализованы внутри клеток в цитоплазме клеточных структурах. В сыворотке крови их активность низкая или они вообще отсутствуют. Поэтому увеличение их активности в сыворотке крови имеет клинико-диагностическое значение. К клеточным ферментам относят АСТ, АЛТ, ЛДГ, альдолазу, ГДГ (глутамат ДГ) и др. Клеточные Е синтезируются любой клеткой организма, т.е. органоспецифичностинет, за исключением изоферментов и синтезируемых в печени СДГ (сорбитолДГ), ОКТ (орнитинкарбомоилтрансфераза).

2. Экскреторные Е – это Е, которые синтезируются в клетках и в норме выделяются на «экспорт» Экскреторные ферменты образуются пищеварительными железами и из их секретов поступают в кровь (амилаза, липаза и др.).

— амилаза синтезируется клетками поджелудочной железы и выделяется в просвет кишечника;

ЩФ синтезируется в печени и выделяется с желчью.

В норме активность этих Е в сыворотке крови низка и постоянна, но если блокируются пути их экскреции, активность в крови возрастает.

3. Секреторныеферменты синтезируются клетками, поступают в

кровь и выполняют специфические функции в кровяном русле, поэтому ихназывают собственно ферментами крови. Это ферменты свертывающей системы и фибринолиза, холинэстераза и др. синтезируются в печенипри патологии органа –«производителя» имеет значение снижение активности этих Е в сыворотке крови.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Источник

Принцип количественного определения активности ферментов. Единицы активности.

Обнаружение ферментов основано на их высокой специфичности. Ферменты обнаруживают по производимому ими действию, т.е. по факту протекания той реакции, которую катализирует данный фермент. Например, амилазу обнаруживают по реакции расщепления крахмала до глюкозы.

Критериями протекания ферментативной реакции могут быть:

• исчезновение субстрата реакции
• появление продуктов реакции
• изменение оптических свойств кофермента.

Так как концентрация ферментов в клетках очень низка, то определяют не их истинную концентрацию, а о количестве фермента судят косвенно, по активности фермента.

Активность ферментов оценивают по скорости ферментативной реакции, протекающей в оптимальных условиях (оптимум температуры, РН, избыточно высокая концентрация субстрата). В этих условиях скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента (V= K₃[F₀]).

Единицы активности (количества) фермента

В клинической практике используют несколько единиц активности фермента.

1. Международная единица – то количество фермента, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата за минуту при температуре 25 0 С.

2. Катал (в системе СИ) – то количество фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата за секунду.

3. Удельная активность – отношение активности фермента к массе белка фермента.

4. Молекулярная активность фермента показывает, сколько молекул субстрата превращается под действием 1 молекулы фермента.

Иммуноферментный анализ, принцип, возможности использования.

Одним из наиболее часто используемых методов в клинической и экспериментальной биохимии, вирусологии, микробиологии, ветеринарии, контроле технологии производства в медицинской и микробиологической промышленности, охране окружающей среды является в настоящее время иммуноферментный анализ (ИФА), в котором ферменты также выступают в качестве неотъемлемого компонента тест-системы.

Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу конъюгата (антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически.

Существует множество вариантов постановки ИФА, из которых наибольшее практическое значение получил гетерогенный твердофазный ИФА. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции.

Самым распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция – процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а так же с помощью образования водородных связей присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые планшеты или полистироловые шарики.

Для ферментативной метки конъюгата могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза.

Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения ИФА. Принципиальная схема твердофазного неконкурентного ИФА состоит из нескольких стадий.

Стадия 1. Специфические антигены пришиты к пластику лунок планшета. В лунку добавляется исследуемая сыворотка, и если в ней есть антитела (эти антитела наз-тся первыми) к данным антигенам, во время инкубации происходит взаимоузнавание, в результате которого образуется принципиально значимая связь антиген/антитело.

Стадия 2. После отмывки лунок от несвязавшихся субстанций в каждую лунку добавляются вторые антитела. Они узнают человеческие антитела определенного типа (IgA, IgG, IgM). К этим вторичным антителам химически пришит активный фермент. такое комплексное соединение называется конъюгат. Во время инкубации происходит взаимоузнавание первых и вторых антител, в результате чего в лунке образуется структура типа «сэндвич».

Стадия 3. После отмывки не связавшегося конъюгата в лунку добавляется бесцветный субстрат, на который действует фермент. в результате субстрат превращается в окрашенный продукт. Количество окрашенного продукта измеряется на фотометре при определенной длине волны.

Таким образом, количество цветного продукта прямо пропорционально количеству фермента в лунке, а значит и количеству конъюгата в «сэндвиче». Количество конъюгата прямо пропорционально тому количеству комплекса антиген-антитело, которое получается на стадии 1 ИФА. Следовательно, измерение развившейся цветной реакции на стадии 3 точно коррелирует с наличием специфических антител в анализируемой сыворотке. Время проведения анализа 1-3 часа.

В клинико-диагностических лабораториях ИФА применяется для следующих целей:

— диагностика инфекционных и паразитарных заболеваний: токсоплазмоза, герпеса, хламидиаза, трихомониаза, вирусов гепатита С и В, коревой краснухи, лямбиоза, микоплазмоза, описторхоза, сифилиса, уреаплазмоза, ВИЧ-инфекции.

— определение содержания гормонов и других биологически активных веществ: лютеинизирующий гормон, фолликолустимулирующий гормон, инсулин, пролактин, тестостерон, прогестерон, эстрадиол, кортизол, тиреотропный гормон, трийодтиронин, тироксин, определение цитокинов и др.

— диагностика ранних сроков беременности

— пренатальная диагностика пороков развития плода

— определение онкомаркеров: альфа-фетопротеина (для печени), раково-эмбриональный антиген (для кишечника), простатспецифический антиген, нейроспецифический антиген (маркер молочной железы), Са-125 (для яичников).

Билет 9

Дата добавления: 2019-07-17 ; просмотров: 752 ; Мы поможем в написании вашей работы!

Источник

Единицы измерения активности ферментов

при изменениях со стороны сердечной мышцы происходит повышение активности сердечного изоферментакреатинфосфокиназы (КФК‑MB), изоферментов лактатдегидрогеназы 1 и 2 (ЛДГ‑1 и ЛДГ‑2),аспартатаминотрансферазы;

нарушения скелетных мышц – мышечного изофермента КФК (КФК‑MM), алкогольдегидрогеназы;

костной ткани – щелочной фосфатазы (ЩФ), альдолазы (АЛД);

поджелудочной железы – a‑амилазы и липазы;

предстательной железы – кислой фосфатазы;

гепатоцитов – аланинаминотрансферазы, глутаматдегидрогеназы, холинэстеразы, сорбитолдегидрогеназы;

желчевыводящих путей – щелочной фосфатазы, g‑глутамилтранс­пептидазы (g‑ГТП).

· ферменты, секретируемые в выводные протоки желчных путей, панкреатических и слюнных протоков. В норме активность таких ферментов в плазме намного ниже, чем в клетках и имеет постоянное значение (a‑амилаза, липаза поджелудочной железы). Изучение активности этих ферментов позволяет судить о функционировании соответствующего органа.

При повышении внутрипротокового давления активность этих ферментов в плазме возрастает за счет “эффекта уклонения ферментов”, т.е. их поступления из протоков железы в кровь и снижения выведения во внешнюю среду. Повышение активности этих ферментов в плазме свидетельствует о блокировании процессов секреции. Примером является панкреатит, закупорка сфинктера Одди желчными камнями, что вызвает переход ферментов поджелудочной железы в кровь. Активность ферментов можно выражать

· в каталах (1 катал = 1 моль/с),

· в единицах активности (1 Е = мкмоль/мин или 1 U, 1 unit — стандартная единица фермента),

· в производных от других единиц измерения (моль/с×л, мкмоль/с×л, мкмоль/ч×мл, мг/ч×мл, в мккат/л,).

Использование ферментов в медицине происходит по трем направлениям:

Энзимодиагностика, энзимотерапия. Применение ферментов как аналитических реагентов при лабораторной диагностике (определение глюкозы, этанола, мочевой кислоты и т.д.)

Энзимодиагностика

До недавнего времени ферменты служили лишь объектом исследования в клинической биохимии, и лишь сравнительно недавно они стали использоваться, как аналитические реагенты, то есть как реактивы для количественного определения других веществ.

Преимущества ферментативных методов исследования: высокая точность, специфичность (в силу специфичности используемых ферментов), чувствительность. К этим «трем китам», на которых стоят ферментативные методы, следует добавить простоту проведения анализа, значительное сокращение времени исследования и, часто, отсутствие необходимости построения калибровочных графиков. Приведем важнейшие ферментативные методы исследования.

На использовании в качестве индикаторного фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Гл.6.Ф.ДГ) основан самый точный из всех существующих метод определения глюкозы. Здесь реакция идет по схеме:

Глюкоза + АТФ гексокиназа глюкозо-6-фосфат + АТФ

Глюкозо-6-фосфат + НАДФ + Гл.6.Ф.ДГ. 6-фосфоглюконат + НАДФН.Н +

Глюкоза при участии гексокиназы фосфорилируется в глюкозо-6-фосфат, который с помощью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы окисляется в 6-фосфоглюконовую кислоту. Эта реакция сопровождается накоплением НАДФН.Н+ и, следовательно, возрастанием оптической плотности при 340 нм.

Другой подход к определению глюкозы основан на использовании сопряженной системы глюкозооксидаза + пероксидаза и более широко известен. При участии глюкозооксидазы глюкоза окисляется кислородом воздуха с образованием перекиси водорода, количество которой определяется по ее способности в присутствии пероксидазы окислять диамины с образованием окрашенных продуктов:

Глюкоза + О₂ + Н₂О глюкозооксидаза глюконовая кислота + Н₂О₂

Н₂О₂ + краситель пероксидаза окрашенный продукт + Н₂О

В качестве красителей (индикаторов) для пероксидазной реакции предложена целая группа веществ: о-толидин, о-дианизидин, фенол + 4-амино-антипирин и др.

Эта же пероксидазная реакция с участием 4-амино-антипирина может быть использована для количественного определения холестерина и триглицеридов.

При определении холестерина его эфиры гидролизуются холестеролэстеразой до свободных жирных кислот и холестерина, который под воздействием холестеролоксидазы окисляется кислородом воздуха до 4-холестерола. Образующаяся при этом перекись водорода в присутствии пероксидазы окисляет вещества – индикаторы с образованием окрашенных соединений, интенсивность окраски которых пропорциональна содержанию холестерина в исследуемом образце:

Эфиры холестерина холестеролэстераза холестерин + R-COOH

Холестерин + О₂ холестеролоксидазы D 4 -холестенон + Н₂О₂

2Н₂О₂ + 4-амино-антипирин + фенол пероксидаза окрашенный продукт + 4Н₂О

Описанный метод определения холестерина является самым точным из ныне существующих. В реакции Либермана-Бурхарда, рутинном методе определения холестерина, участвуют и другие стерины, что приводит к завышенным результатам. К другим преимуществам ферментативного метода следует отнести отсутствие влияния примесей билирубина и гемоглобина, необходимости проводить длительный гидролиз эфиров и экстракцию холестерина, отсутствие агрессивных реагентов.

Еще более сложная ферментная система может быть использована для определения триглицеридов. Триглицериды расщепляются липазой до жирных кислот и глицерина, который при участии глицерокиназы и АТФ фосфорилируется с образованием глицерол-3-фосфата. Глицерол-3-фосфат в присутствии глицерофосфатоксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием фосфодиоксиацетона и перекиси кислорода, которая в свою очередь окисляет краситель с образованием окрашенного комплекса, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации триглицеридов в исследуемом образце.

Триглицерид + 3 Н₂О липаза глицерин + 3 R-СООН

Глицерин + АТФ глицерокиназа глицерол — 3 фосфат + АТФ

Глицерол — 3 фосфат + О₂ глицеролфосфат фосфодиоксиацетон + Н₂О₂

Н₂О₂ + 4 — аминоантипирин + 4 — хлорфенол пероксидаза

окрашенный комплекс + 2Н₂О + НСl

Этот метод определения триглицеридов наиболее специфичен, исключительно точен и чрезвычайно прост в исполнении.

В настоящее время разработана целая группа ферментативных методов определения мочевой кислоты. Первым этапом этих методов является расщепление мочевой кислоты уриказой до аллантоина, углекислоты и перекиси водорода:

Мочевая кислота + 2 Н₂О + О₂ уриказа аллантоин + СО₂ + Н₂О₂.

Образовавшаяся перекись водорода может быть определена разными способами:

1) По реакции с 4- аминоантипирином или другим аналогичным

2) Превращением метанола с участием каталазы в формальдегид, который определяется специальными методами.

3) Окислением перекисью этанола в ацетатальдегид, который затем восстанавливается НАДH.H+ (оптический тест Варбурга).

Следует отметить высокую специфичность всех ферментативных методов определения мочевой кислоты по сравнению с рутинными фосфорновольфрамовыми методами т. к. кроме мочевой кислоты фосфорновольфрамовую кислоту восстанавливает аскорбиновая кислота, тирозин, триптофан, цистин, цистеин и др.

Еще большее количество методов предложено для ферментативного определения мочевины. Первым этапом всех этих методов является расщепление мочевины уреазой до аммиака и углекислоты:

Определение ионов аммония может быть осуществлено разными способами:

1) классической Бертолетовой реакцией

2) модифицированной Бертолетовой реакцией с салицилатом натрия

3) с помощью оптического теста Варбурга

В последнем случае в качестве индикаторной служит реакция:

NH + + a-кетоглутарат + НАДН глутаматдегидрогеназа глутамат + НАД + + 2 Н₂О

Все эти методы высокоспецифичны, т. к. для уреазы мочевина является единственным физиологическим субстратом, но наиболее точным является метод с оптическим методом Варбурга.

В заключение следует сказать о новом направлении в использовании ферментов: ферментативных методах определения электролитов (К+, Nа+, Сl+). Эти методы основаны на способности электролитов оказывать активирующее влияние на активность некоторых ферментов.

Энзимотерапия

Энзимы (или ферменты) составляют основу жизнедеятельности живого организма. Все без исключения биохимические процессы происходят при непосредственном их участии. Энзимы обеспечивают защиту организма от вредных воздействий окружающей среды и микроорганизмов (бактерий, вирусов), контролируют обмен веществ, рост и регенерацию тканей, размножение, наконец.

Энзимная недостаточность, возникающая при генетических нарушениях или под воздействием как внешних, так и внутренних факторов может привести к ряду серьезных заболеваний.

Хорошо известно то, что недостаток энзимов, скажем в пищеварительном тракте, можно восполнить препаратами этих веществ, производимых поджелудочной железой или же то, что протеолитические энзимы можно использовать для очистки ран и других – внешних и внутренних – поврежденных участков организма. Это примеры локальной (местной) энзимотерапии.

Когда же речь идет о целенаправленно составленных энзимных смесях гидролитических энзимов, лечебная эффективность которых основана на комплексном воздействии на ключевые процессы, происходящие в организме, мы говорим о системной энзимотерапии.

Метод системной энзимотерапии основан на кооперативном терапевтическом воздействии целенаправленно составленных смесей гидролитических ферментов растительного и животного происхождения. Благодаря влиянию на ключевые патофизиологические процессы в организме, препараты системной энзимотерапии обладают противовоспалительным, противоотечным, фибринолитическим, иммуномодулирующим и вторично анальгезирующим действием. Кроме того, назначение данных препаратов приводит к снижению активности воспалительных процессов и модуляции физиологических защитных реакций организма.

Системная энзимотерапия как новый метод лечения была предложена известным американским врачом и биохимиком профессором Максом Вольфом совместно с биохимиком Хеленой Бенитез в начале прошлого века. Именно они эмпирическим путем составляли и испытывали разные комбинации энзимов. Они же доказали, что крупные белковые молекулы энзимов способны всасываться из просвета тонкого кишечника в кровь в неизмененном виде. Другу и соратнику М. Вольфа профессору Карлу Рансбергеру, одному из основоположников нового метода лечения, принадлежит основная роль по внедрению системной энзимотерапии в лечебную практику. Благодаря нему, например в Германии, препараты вобэнзим, флогэнзим, вобэ-мугос Е стали одними из наиболее распространенных и часто применяемых лекарств.

Отечественными учеными показано успешное использование системной энзимотерапии в ревматологии (при ревматоидном артрите, ювенильном ревматоидном артрите, системной красной волчанке, системных васкулитах и т.д.), сосудистой хирургии (для лечения тромбофлебитов, перифлебитов, атеросклеротическом поражении сосудов и др.), гинекологии и урологии (при урогенитальных хламидиозах, хронических аднекситах и т.д.), травматологии и ортопедии (в лечении травм, в том числе спортивных, эндопротезировании тазобедренных суставов и др.).

Источник

21 .Классификация и номенклатура ферментов. Изоферменты. Единицы измерения активности и количества ферментов.

Каждый фермент имеет 2 названия. Первое — короткое, так называемое рабочее, удобное для повседневного использования. Второе (более полное) — систематическое, применяемое для однозначной идентификации фермента.

Рабочее название. В названии большинства ферментов содержится суффикс «аза», присоединённый к названию субстрата реакции, например уреаза, сахараза, липаза, нуклеаза или к названию химического превращения определённого субстрата, например лактатдегидрогеназа, аденилатциклаза, фосфо-глюкомутаза, пируваткарбоксилаза. Согласно российской классификации ферментов (КФ), названия ферментов пишутся слитно. Однако в употреблении сохранился ряд тривиальных, исторически закреплённых названий ферментов, которые не дают представления ни о субстрате, ни о типе химического превращения, например трипсин, пепсин, ренин, тромбин.

Классы ферментов. Международный союз биохимии и молекулярной биологии в 1961 г. разработал систематическую номенклатуру, согласно которой все ферменты разбиты на 6 основных классов в зависимости от типа катализируемой химической реакции. Каждый класс состоит из многочисленных подклассов и подподклассов с учётом преобразуемой химической группы субстрата, донора и акцептора преобразуемых группировок, наличия дополнительных молекул и т.д. Каждый из 6 классов имеет свой порядковый номер, строго закреплённый за ним.

Оксидоредуктазы. Катализируют различные окислительно-восстановительные реакции с участием 2 субстратов (перенос е — или атомов водорода с одного субстрата на другой).

Трансферазы. Катализируют перенос функциональных групп от одного соединения к другому. Подразделяют в зависимости от переносимой группы.

Гидролазы. Катализируют реакции гидролиза (расщепления ковалентной связи с присоединением молекулы воды по месту разрыва). Подразделяют в зависимости от расщепляемой связи.

Лиазы. К лиазам относят ферменты, отщепляющие от субстратов негидролитическим путём определённую группу (при этом могут отщепляться СО₂, Н₂О, NH₂,SН₂и др.) или присоединяющие чаще всего молекулу воды по двойной связи.

Изомеразы. Катализируют различные внутримолекулярные превращения. Подразделяют в зависимости от типа реакции изомеризации.

Лигазы (синтетазы). Катализируют реакции присоединения друг к другу двух молекул с образованием ковалент-ной связи. Этот процесс сопряжён с разрывом фосфоэфирной связи в молекуле АТФ (или других нуклеозидтрифосфатов) или с разрывом макроэргических связей других соединений. В первом случае (при использовании энергии гидролиза АТФ) такие ферменты называют лигазами, или синтетазами

Изоферменты, или изоэнзимы — это различные по аминокислотной последовательности изоформы или изотипы одного и того же фермента, существующие в одноморганизме, но, как правило, в разных его клетках, тканях или органах. Изоферменты, как правило, высоко гомологичны по аминокислотной последовательности и/или подобны по пространственной конфигурации. Особенно консервативны в сохранении строения активные центры молекул изоферментов. Все изоферменты одного и того же фермента выполняют одну и ту же каталитическую функцию, но могут значительно различаться по степени каталитической активности, по особенностям регуляции или другим свойствам.

Одна международная единица активности (ME) соответствует такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при оптимальных условиях проведения ферментативной реакции. Оптимальные условия индивидуальны для каждого фермента и зависят от температуры среды, рН раствора, при отсутствии активаторов и ингибиторов

. .

Количество единиц активности nME определяют по формуле:

В 1973 г. была принята новая единица активности ферментов: 1 катал (кат), соответствующий такому количеству катализатора, которое превращает 1 моль субстрата за 1 с.

Международная единица ферментативной активности ME связана с каталом следующими равенствами:

1 кат = 1 моль S/c = 60 моль S/мин = 60х106 мкмоль/мин = 6х107 ME,

1 ME = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/с = 1/60 мккат = 16,67 нкат.

В медицинской и фармацевтической практике для оценки активности ферментов часто используют международные единицы активности — ME. Для оценки количества молекул фермента среди других белков данной ткани определяют удельную активность (уд. ак.) фермента, численно равную количеству единиц активности фермента (nМЕ) в образце ткани, делённому на массу (мг) белка в этой ткани.

Источник